新闻科研进展
近日，武汉病毒所/华中科技大学/南开大学联合团队在布尼亚病毒核酸内切酶的催化机制，以及基于结构的药物干预机制研究中取得重要进展。两篇相关研究成果“Insights into two-mietal-ion catalytic mechanism of cap-snatching endonuclease of Ebinur Lake virus in Bunyavirales”，以及 “Structural and biochemical basis for development of diketo acid inhibitors targeting the cap snatching endonuclease of the Ebinur Lake virus (order: Bunyavirales)”相继在线发表在Journal of Virology上。
布尼亚病毒包含许多重要的人和动物病原，对公共健康和农牧业构成了严重威胁，目前尚未有针对该类病毒的疫苗和特异性治疗药物。艾比湖病毒（Ebinur Lake virus，EBIV）是近年在我国新疆艾比湖地区发现的一种新型蚊媒布尼亚病毒，前期研究结果表明EBIV对我国人口健康构成潜在生物安全风险。包括布尼亚病毒和流感病毒在内的分节段负链RNA病毒普遍利用一种独特的“夺帽”机制来起始病毒的转录。夺帽过程由病毒编码的L蛋白执行，该蛋白中段为依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP），N端区域包含核酸内切酶（endonuclease，EN）结构域，C端区域包含帽子结合域（cap binding domain，CBD），在CBD的协同作用下，由EN实现宿主mRNA的切割。由于切割得到的含5'帽子结构的寡核苷酸被用作RdRP转录的引物，因此EN可作为重要的病毒干预靶点。
研究团队首先解析了一系列高分辨率（2.0-2.6埃）的EBIV EN野生型和活性位点突变体晶体结构，并结合体外核酸内切酶生化实验，深入分析了EN活性位点结构与功能之间的关系。研究结果显示，EBIV EN是一种二价金属离子依赖的RNA核酸内切酶，能特异性切割富含尿嘧啶且不含二级结构的单链RNA，其酶活严格依赖活性位点两个金属离子的结合（图1）。EBIV EN野生型和突变体蛋白的晶体结构分析进一步支持双金属离子催化机制，且两个金属离子在活性位点上的结合具有相关性。该研究为深入理解分节段负链 RNA 病毒核酸内切酶的工作机制提供了重要证据。
图1. EBIV EN的活性依赖于活性位点两个二价金属离子的结合。（A）EBIV EN活性位点区域的立体对象图。（B）EBIV EN 野生型和活性位点突变体的核酸内切酶活性分析。
在此基础上，研究团队进一步对EBIV EN的干预机制进行了研究。研究团队首先以EN金属螯合型抑制剂二酮酸类化合物L-742,001为原型，设计和合成了一系列衍生化合物，随后结合酶学，病毒学和晶体学方法对这些化合物的构效关系进行了深入探究。研究结果表明，L-742,001及其9种衍生物能以不同程度抑制EBIV EN的体外酶活和细胞水平上的病毒复制。EN与抑制剂复合物晶体结构分析（图2）进一步显示，L-742,001的二酮酯基团通过金属螯合作用占据EN的活性中心，对氯苯基团则与活性位点残基形成稳定的疏水堆积作用，二者对其活性至关重要；其苯基由于结构上的灵活性和结合口袋的开放性，可以采用多种构象与活性位点相互作用，因此是最具优化潜力的基团。该研究揭示了L-742,001二酮酸类化合物干预 EN 的分子机制，为靶向分节段负链RNA病毒EN的广谱抑制剂设计和优化提供了重要的科学依据。
图2. L-742,001及其衍生物IN5, IN16与EBIV EN的结合模式。EBIV EN活性位点参与抑制剂结合的关键氨基酸以白色棍状模型显示，L-742,001及其衍生物以黄色棍状模型显示，锰离子以青色球体显示。
华中科技大学同济医学院法医学系博士后匡文华为两篇论文的第一作者；武汉病毒所龚鹏研究员/华中科技大学的周亦武教授、武汉病毒所胡志红研究员/南开大学郭宇教授，分别为两篇论文的共同通讯作者。研究得到了国家重点研发计划（2018YFA0507200，2018YFA0507203）、中国科学院武汉国家生物安全实验室高端用户培育项目（2021ACCP-MS10，2020-NBL-ZD-00030，2018ACCP-ZD02），病毒学国家重点实验室开放研究基金项目（2020IOV003），中国博士后科学基金（2018M632827），湖北江夏实验室生物安全科技重点项目（JXBS001）和湖北省自然科学基金杰青项目（2021CFA050）等经费的支持。
文章链接：
1. https://doi.org/10.1128/jvi.02085-21
2. https://doi.org/10.1128/jvi.02173-21