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2022年12月，国际学术期刊《Nature Communications》在线发表了中国科学院武汉病毒研究所罗敏华团队的最新成果，论文题目为“An HSV-1-H129 amplicon tracer system for rapid and efficient monosynaptic anterograde neural circuit tracing”。该研究基于HSV-1 H129扩增子与H129-dTK-T2进行多轮病毒改造，研发出标记亮度高、实验周期短（5天）、操作简单（1次病毒注射）、标记的下游神经元毒性低的新型顺向跨单级示踪工具系统H129Amp。
绘制脑神经网络联结图谱对解析大脑结构与功能不可或缺。神经环路示踪病毒工具是解析脑联结图谱的重要工具。罗敏华课题组首先对HSV-1 H129株进行改造，开发了携带2x GFP和2x mGFP的高亮度的顺向跨多级示踪工具H129-G4。H129-G4荧光强度高，可展示神经元树突棘等细节，为首个与fMOST联用的顺向示踪工具。在该病毒改造平台基础上，团队开发并首次报道了顺向跨单级示踪工具H129-dTK-tdT（Mol Neurodegener. 2017. 12:38），填补了顺向跨单级示踪工具的空白，实现了0到1的突破。团队随后研发了H129-dTK-T2，提高标记亮度，优化了生产和应用工艺 (Neurosci Bull. 2020.37:701)。为增强顺向跨单级示踪工具的标记强度和效率、缩短示踪时间、并降低其末端吸收，该团队靶向H129的gK基因，构建突变gK囊膜化的顺向跨单级示踪工具H129-dgK-G4。H129-dgK-G4展示了更高标记强度和示踪效率、更特异的顺向标记特性、缩短了示踪时间（Mol Neurodegener. 2022. 17:6）。
该团队进一步采取全新策略，以H129-dTK-T2-pacFlox作为辅助病毒，H129扩增子作为示踪病毒，构建了H129Amp示踪系统。示踪病毒H129Amp含多拷贝串联的标记基因（靶基因），可快速、高效表达靶标蛋白，标记下游神经元；传播到下游神经元的H129Amp示踪病毒，不含任何病毒毒性基因，对下游神经元无/低毒性。除基因组不同外，辅助病毒与示踪病毒结构和感染特性一致，可混合后同时注射（单次），5天后可高亮标记下游神经元，结合光遗传学工具AAV-DIO-ChR2或H129-dgK-G4顺向跨单级示踪工具系统，可进行功能性研究或顺向跨两级示踪。与传统示踪工具相比，其优势包括 1）该系统具有标记亮度高，不需要免疫染色以放大信号；2）实验周期短， 由30天缩短至5天，大大缩短了实验周期；3） 操作简单和避免空间错位，单次病毒注射替代了原来的2次序贯性（第1、21天）病毒注射，简化了操作，避免了2次注射导致的空间错位，重复性和标记效率高；4）下游神经元无/低毒性，可进行功能研究、顺向跨两级研究等。有望进一步推动神经科学和脑计划。
该研究得到了国家自然科学基金（81620108021, 82172264, 32070169, 81571355, 81601206）的资助。武汉病毒所博士生熊锋（现中科院精密测量科学和技术创新研究院博士后）和杨虹为共同第一作者，武汉病毒所罗敏华研究员、曾文波副研究员、北京脑科学与类脑研究中心载体中心主任赵非为共同通讯作者。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35355-6.pdf.
图：在野生型C57BL/6小鼠听觉皮层快速高亮示踪下游脑区
a. 简化的听皮层环路示意图；b. 实验流程示意图；c-d. 注射位点代表性标记图；e-i. 听皮层下游代表性标记图。